Nossos ossos são formados por dois processos principais chamados de ossificação intramembranosa e ossificação endocondral. A ossificação intramembranosa origina os ossos chatos do crânio, parte da mandíbula e clavículas. Essa ossificação ocorre quando células embrionárias com alta capacidade de migração e diferenciação, chamadas de células mesenquimais, se agregam nas regiões onde os ossos irão se formar e se diferenciam diretamente em osteoblastos (células que produzem a matriz óssea) (Figura 1). A ossificação endocondral, por sua vez, dá origem aos ossos da base do crânio, vértebras e aos ossos longos (como o fêmur – o maior osso do corpo humano!). Esse processo é mais lento que a ossificação intramembranosa, pois as células mesenquimais primeiramente se diferenciam em condrócitos, os quais produzem um molde de cartilagem que é posteriormente utilizado para deposição da matriz óssea (Figura 1). A ossificação endocondral se inicia durante o desenvolvimento embrionário e continua durante a infância e adolescência, o que permite o crescimento longitudinal dos ossos. Esse processo de crescimento tem despertado a curiosidade de pesquisadores por muitos anos. Mais especificamente, estudos têm buscado entender a origem das células que permitem que os ossos longos continuem crescendo por tantos anos após o nascimento.
Figura 1: Imagens de microscopia mostrando osteoblastos e osteoclastos. Na imagem da esquerda pode-se observar osteoblastos (em roxo), na superfície externa de um osso em desenvolvimento (região rosa no centro da imagem). Normalmente, osteoblastos são organizados em grupos de células conectadase enquanto sintetizam a matriz ossea (https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=19552608). Na imagem da direita pode-se observar a morfologia dos condrócitos, os quais produzem todas as moléculas que dao suporte ao tecido cartilaginoso (http://medcell.med.yale.edu/histology/connective_tissue_lab/chondrocytes.php).
Durante a ossificação endocondral os condrócitos se organizam em diferentes zonas dentro do molde cartilaginoso, dependendo de seu estado de maturação (Figura 2). Condrócitos mais imaturos se localizam nas extremidades (que formarão as epífises), enquanto condrócitos mais maduros se localizam na região central do molde cartilaginoso (que formará a diáfise). Condrócitos mais imaturos, pequenos e arredondados formam a zona de reserva, que se diferenciam em condrócitos achatados e estão organizados em colunas na direção do eixo longitudinal do osso formando a zona proliferativa. Ao longo do tempo, condrócitos proliferativos param de se proliferar e aumentam de tamanho, formando a zona hipertrófica. Os condrócitos hipertróficos, por sua vez, morrem por apoptose permitindo a entrada de vasos sanguíneos na região central do molde cartilaginoso formando o centro primário de ossificação. Os vasos sanguíneos trazem células que auxiliam na remoção da matriz cartilaginosa (condroclastos) e células que depositam matriz óssea (osteoblastos), além de outras células que formarão a medula óssea (Figura 2).
Figura 2: Ossificação endocondral. (A) células mesenquimais se agregam em regiões que formarão ossos. (B) células mesenquimais se diferenciam em condrócitos e formam um molde cartilaginoso. (C) Após proliferação condrócitos passam por um processo progressivo de maturação, formando as zonas de reserva, proliferação e hipertrofia. (D) condrócitos hipertróficos, morrem por apoptose permitindo a entrada de vasos sanguíneos, degradação da matriz cartilaginosa e deposição da matriz óssea (Adaptado de Fanxin Long and David M. Ornitz, 2013).
Após a formação do centro primário de ossificação, a maioria do molde de cartilagem na diáfise é degradado ou substituído por matriz óssea. Com o passar do tempo, ocorre a formação de centros de ossificação secundários (COS) nas epífises, e regiões de cartilagem se mantém apenas na placa de crescimento (ou placa epifisária). A placa de crescimento, assim como o molde cartilaginoso inicial, é dividida em zonas de reserva, proliferação e hipertrofia (Figura 3) e mesmo sendo formada durante o período embrionário, é responsável pelo crescimento longitudinal dos ossos na infância e adolescência.
Figura 3: (A) zonas de reserva, proliferação e hipertrofia se restringem à epífise após a invasão do molde cartilaginoso por vasos sanguíneos e deposição da matriz óssea – 3 dias após o nascimento. (B) Em estágios mais avançados de desenvolvimento (30 dias após o nascimento), centros secundários de ossificação se formam nas epífises, restringindo a área da placa de crescimento. (Adaptado de: Newton et al 2019)
De acordo com a teoria proposta para explicar o crescimento longitudinal dos ossos, os condrócitos da zona de reserva, são consumidos gradualmente quando recrutados para a zona proliferativa, onde se proliferam antes de se tornarem hipertróficos e morrerem. Essa teoria, porém, nunca foi observada na prática. Em um artigo publicado na revista Nature em março de 2019, cientistas no Karolinska Institutet, Stockholm, na Suécia investigaram essa teoria. Com o intuito de encontrar as células que possibilitam o crescimento longitudinal dos ossos, os pesquisadores criaram uma linhagem de camundongos transgênicos denominada de Col2-creert:R26R-Confetti. Esses camundongos tem a incrível habilidade de expressar variadas proteínas fluorescentes em diferentes condrócitos. Quando um condrócito expressa uma das proteínas fluorescentes, todas as suas células filhas após divisão celular expressam a mesma proteína, o que permite acompanhar toda a linhagem celular proveniente de condrócitos individuais ao longo do desenvolvimento (Figura 4).
Figura 4. Exemplos de placas de crescimento de camundongos. (A) coloração com hematoxilina e eosina de uma placa de crescimento de uma tíbia de camundongo, onde é possível observar em roxo as colunas com condrócitos proliferativos (Adaptado de Arita et all., 2017). (B) Imagem de uma placa de crescimento dos camundongos Col2-creert:R26R-Confetti 28 dias após seu nascimento. Diferentes colunas de condrócitos proliferativos são observadas em diferentes cores. Cada coluna apresenta apenas uma cor, indicando que todos os condrócitos naquela coluna são provenientes de um precursor original.
Utilizando os camundongos transgênicos em diferentes pontos do desenvolvimento, os pesquisadores conseguiram demonstrar que durante o período fetal e neonatal os condrócitos da zona de proliferação se originam de múltiplos clones, ou seja, diferentes células da zona de reserva são recrutadas para formar a zona proliferativa (Figura 5 A e B). Essa observação corrobora a teoria inicial de que as células da zona de reserva são consumidas gradualmente quando utilizadas para o crescimento longitudinal dos ossos. Surpreendentemente, após 30 dias de seu nascimento, as colunas de condrócitos proliferativos passam a ser monoclonais, ou seja, cada coluna passa a se originar de apenas uma célula precursora, por isso apresenta só uma cor (Figura 5 C e D). Esses resultados indicam que há uma mudança entre as células que participam no alongamento dos ossos durante o período fetal e neonatal e as células que participam nesse alongamento em estágios mais tardios do desenvolvimento.
Figura 5: Rastreamento de condrócitos de camundongos Col2-creert:R26R-Confetti nos períodos neonatal e juvenil mostram diferentes células participando do alongamento dos ossos. Placas de crescimento de camundongos. (A) Rastreamento de condrócitos desde o nascimento até 10 dias de vida mostra uma epífise com uma ampla zona de reserva, onde cada clone (cada condrócito) é marcado com uma proteína fluorescente. (B) Ampliação da zona de proliferação mostra que as colunas se originam de múltiplos clones (múltiplos condrócitos da zona de reserva) que se dividem aumentando as colunas. (C) Placa de crescimento de camundongos juvenis (após 30 dias de nascimento), possuem uma menor zona de reserva. (D) Ampliação da zona de proliferação mostra que colunas passam a ser monoclonais, ou seja, se originam de apenas uma célula precursora, apresentando apenas uma cor (Adaptado de Newton et all., 2019).
Essa mudança na zona proliferativa, antes formada por vários precursores e depois formado por um precursor com maior capacidade de proliferação, sugere que a população de condrócitos progenitores na zona de reserva diminui com o passar do tempo. Entretanto, após a formação da placa de crescimento, os condroprogenitores (células que dão origem aos condrócitos) restantes adquirem a capacidade de auto-renovação, necessária para a continuidade do crescimento longitudinal dos ossos. A aquisição da capacidade de auto-renovação dos condroprogenitores ocorre ao mesmo tempo em que um centro de ossificação secundário (COS) está se formando na região das epífises (Figura 3B). A formação do COS muda o microambiente próximo a placa de crescimento, com a invasão de vasos sanguíneos, reorganização da matriz extracelular, entre outros fatores. Curiosamente, os pesquisadores sugeriram que esse microambiente é um dos fatores para que os condroprogenitores adquiram uma capacidade de auto-renovação que eles não tinham antes.
A auto-renovação é uma das características que definem uma célula-tronco, mas para comprovar que os condroprogenitores restantes são de fato células-tronco, células individuais foram isoladas por captura a laser, e os genes expressos foram analisados. Os condroprogenitores expressaram marcadores típicos de células-tronco como CD73, CD49e, ativação de mTORC1, e quando cultivados em placas de cultura foram capazes de se diferenciar em outros tipos celulares. Todas essas características demonstram que os condroprogenitores são, na verdade, células-tronco. A descoberta de um nicho de células-tronco na epífise é animadora, pois a presença de tais nichos já havia sido demonstrada em outros tecidos que apresentam uma necessidade de regeneração contínua, como a pele, o sangue e o intestino, mas nunca havia sido demonstrada nos ossos.
Em resumo, um nicho de células-tronco se forma após o nascimento na placa de crescimento dos ossos longos. Esse nicho facilita a auto-renovação dos condroprogenitores e possibilita que haja um contínuo suprimento de condrócitos para o crescimento dos ossos (Figura 6). O conhecimento desse nicho e de como as células agem permitindo o crescimento ósseo nos auxilia no entendimento do processo de formação de nosso esqueleto, mas também pode ser usado para entender como doenças se originam. É importante ressaltar que esse estudo foi conduzido em camundongos, e ainda não é claro se esses mecanismos são conservados em humanos. Caso isso seja confirmado, estudos futuros podem focar em estratégias para modular o crescimento ósseo, incluindo exercícios físicos, dietas e administração de moléculas que podem auxiliar no tratamento de crianças com desordens de crescimento.
Figura 6: Resumo ilustrativo dos mecanismos de crescimento dos ossos longos com o passar do tempo. Durante o período fetal e neonatal, diferentes células da zona de reserva são recrutadas para a zona proliferativa, levando ao crescimento ósseo. Após a formação do COS, células de reserva diminuem e os condroprogenitores restantes adquirem a capacidade de auto-renovação, assim como outras características de células-tronco (sc). Essas células-tronco por sua vez, passam a ser responsáveis pelo crescimento longitudinal dos ossos.
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