0

Nicho recém descoberto de células-tronco nos ossos longos pode explicar como crescemos

Nossos ossos são formados por dois processos principais chamados de ossificação intramembranosa e ossificação endocondral. A ossificação intramembranosa origina os ossos chatos do crânio, parte da mandíbula e clavículas. Essa ossificação ocorre quando células embrionárias com alta capacidade de migração e diferenciação,  chamadas de células mesenquimais, se agregam nas regiões onde os ossos irão se formar e se diferenciam diretamente em osteoblastos (células que produzem a matriz óssea) (Figura 1). A ossificação endocondral, por sua vez, dá origem aos ossos da base do crânio, vértebras e aos ossos longos (como o fêmur – o maior osso do corpo humano!). Esse processo é mais lento que a ossificação intramembranosa, pois as células mesenquimais primeiramente se diferenciam em condrócitos, os quais produzem um molde de cartilagem que é posteriormente utilizado para deposição da matriz óssea (Figura 1). A ossificação endocondral se inicia durante o desenvolvimento embrionário e continua durante a infância e adolescência, o que permite o crescimento longitudinal dos ossos. Esse processo de crescimento tem despertado a curiosidade de pesquisadores por muitos anos. Mais especificamente, estudos têm buscado entender a origem das células que permitem que os ossos longos continuem crescendo por tantos anos após o nascimento.

ARSI antibody specificity

Figura 1: Imagens de microscopia mostrando osteoblastos e osteoclastos. Na imagem da esquerda pode-se observar osteoblastos (em roxo), na superfície externa de um osso em desenvolvimento (região rosa no centro da imagem). Normalmente, osteoblastos são organizados em grupos de células conectadase enquanto sintetizam a matriz ossea (https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=19552608). Na imagem da direita pode-se observar a morfologia dos condrócitos, os quais produzem todas as moléculas que dao suporte ao tecido cartilaginoso (http://medcell.med.yale.edu/histology/connective_tissue_lab/chondrocytes.php).

Durante a ossificação endocondral os condrócitos se organizam em diferentes zonas dentro do molde cartilaginoso, dependendo de seu estado de maturação (Figura 2). Condrócitos mais imaturos se localizam nas extremidades (que formarão as epífises), enquanto condrócitos mais maduros se localizam na região central do molde cartilaginoso (que formará a diáfise). Condrócitos mais imaturos, pequenos e arredondados formam a zona de reserva, que se diferenciam em condrócitos achatados e estão organizados em colunas na direção do eixo longitudinal do osso formando a zona proliferativa. Ao longo do tempo, condrócitos proliferativos param de se proliferar e aumentam de tamanho, formando a zona hipertrófica. Os condrócitos hipertróficos, por sua vez, morrem por apoptose permitindo a entrada de vasos sanguíneos na região central do molde cartilaginoso formando o centro primário de ossificação. Os vasos sanguíneos trazem células que auxiliam na remoção da matriz cartilaginosa (condroclastos) e células que depositam matriz óssea (osteoblastos), além de outras células que formarão a medula óssea (Figura 2).

fIG1 OSSIFICACAO

Figura 2: Ossificação endocondral. (A)  células mesenquimais se agregam em regiões que formarão ossos. (B) células mesenquimais se diferenciam em condrócitos e formam um molde cartilaginoso. (C) Após proliferação condrócitos passam por um processo progressivo de maturação, formando as zonas de reserva, proliferação e hipertrofia. (D) condrócitos hipertróficos, morrem por apoptose permitindo a entrada de vasos sanguíneos, degradação da matriz cartilaginosa e deposição da matriz óssea (Adaptado de Fanxin Long and David M. Ornitz, 2013).

Após a formação do centro primário de ossificação, a maioria do molde de cartilagem na diáfise é degradado ou substituído por matriz óssea. Com o passar do tempo, ocorre a formação de centros de ossificação secundários (COS) nas epífises, e regiões de cartilagem se mantém apenas na placa de crescimento (ou placa epifisária). A placa de crescimento, assim como o molde cartilaginoso inicial, é dividida em zonas de reserva, proliferação e hipertrofia (Figura 3) e mesmo sendo formada durante o período embrionário, é responsável pelo crescimento longitudinal dos ossos na infância e adolescência.
Figure2growthplate.png

Figura 3: (A) zonas de reserva, proliferação e hipertrofia se restringem à epífise após a invasão do molde cartilaginoso por vasos sanguíneos e deposição da matriz óssea – 3 dias após o nascimento. (B) Em estágios mais avançados de desenvolvimento (30 dias após o nascimento), centros secundários de ossificação se formam nas epífises, restringindo a área da placa de crescimento. (Adaptado de: Newton et al 2019)

De acordo com a teoria proposta para explicar o crescimento longitudinal dos ossos, os condrócitos da zona de reserva, são consumidos gradualmente quando recrutados para a zona proliferativa, onde se proliferam antes de se tornarem hipertróficos e morrerem. Essa teoria, porém, nunca foi observada na prática. Em um artigo publicado na revista Nature em março de 2019, cientistas no Karolinska Institutet, Stockholm, na Suécia investigaram essa teoria. Com o intuito de encontrar as células que possibilitam o crescimento longitudinal dos ossos, os pesquisadores criaram uma linhagem de camundongos transgênicos denominada de Col2-creert:R26R-Confetti. Esses camundongos tem a incrível habilidade de expressar variadas proteínas fluorescentes em diferentes condrócitos. Quando um condrócito expressa uma das proteínas fluorescentes, todas as suas células filhas após divisão celular expressam a mesma proteína, o que permite acompanhar toda a linhagem celular proveniente de condrócitos individuais ao longo do desenvolvimento (Figura 4).

figure3

Figura 4. Exemplos de placas de crescimento de camundongos. (A) coloração com hematoxilina e eosina de uma placa de crescimento de uma tíbia de camundongo, onde é possível observar em roxo as colunas com condrócitos proliferativos (Adaptado de Arita et all., 2017). (B) Imagem de uma placa de crescimento dos camundongos Col2-creert:R26R-Confetti 28 dias após seu nascimento. Diferentes colunas de condrócitos proliferativos são observadas em diferentes cores. Cada coluna apresenta apenas uma cor, indicando que todos os condrócitos naquela coluna são provenientes de um precursor original.

Utilizando os camundongos transgênicos em diferentes pontos do desenvolvimento, os pesquisadores conseguiram demonstrar que durante o período fetal e neonatal os condrócitos da zona de proliferação se originam de múltiplos clones, ou seja, diferentes células da zona de reserva são recrutadas para formar a zona proliferativa (Figura 5 A e B). Essa observação corrobora a teoria inicial de que as células da zona de reserva são consumidas gradualmente quando utilizadas para o crescimento longitudinal dos ossos. Surpreendentemente, após 30 dias de seu nascimento, as colunas de condrócitos proliferativos passam a ser monoclonais, ou seja, cada coluna passa a se originar de apenas uma célula precursora, por isso apresenta só uma cor (Figura 5 C e D). Esses resultados indicam que há uma mudança entre as células que participam no alongamento dos ossos durante o período fetal e neonatal e as células que participam nesse alongamento em estágios mais tardios do desenvolvimento.

fIGURE4

Figura 5: Rastreamento de condrócitos de camundongos Col2-creert:R26R-Confetti nos períodos neonatal e juvenil mostram diferentes células participando do alongamento dos ossos. Placas de crescimento de camundongos. (A) Rastreamento de condrócitos desde o nascimento até 10 dias de vida mostra uma epífise com uma ampla zona de reserva, onde cada clone (cada condrócito) é marcado com uma proteína fluorescente. (B) Ampliação da zona de proliferação mostra que as colunas se originam de múltiplos clones (múltiplos condrócitos da zona de reserva) que se dividem aumentando as colunas. (C) Placa de crescimento de camundongos juvenis (após 30 dias de nascimento), possuem uma menor zona de reserva. (D) Ampliação da zona de proliferação mostra que colunas passam a ser monoclonais, ou seja, se originam de apenas uma célula precursora, apresentando apenas uma cor (Adaptado de Newton et all., 2019).

Essa mudança na zona proliferativa, antes formada por vários precursores e depois formado por um precursor com maior capacidade de proliferação, sugere que a população de condrócitos progenitores na zona de reserva diminui com o passar do tempo. Entretanto, após a formação da placa de crescimento, os condroprogenitores (células que dão origem aos condrócitos) restantes adquirem a capacidade de auto-renovação, necessária para a continuidade do crescimento longitudinal dos ossos. A aquisição da capacidade de auto-renovação dos condroprogenitores ocorre ao mesmo tempo em que um centro de ossificação secundário (COS) está se formando na região das epífises (Figura 3B). A formação do COS muda o microambiente próximo a placa de crescimento, com a invasão de vasos sanguíneos, reorganização da matriz extracelular, entre outros fatores. Curiosamente, os pesquisadores sugeriram que esse microambiente é um dos fatores para que os condroprogenitores adquiram uma capacidade de auto-renovação que eles não tinham antes.

A auto-renovação é uma das características que definem uma célula-tronco, mas para comprovar que os condroprogenitores restantes são de fato células-tronco, células individuais foram isoladas por captura a laser, e os genes expressos foram analisados. Os condroprogenitores expressaram marcadores típicos de células-tronco como CD73, CD49e, ativação de mTORC1, e quando cultivados em placas de cultura foram capazes de se diferenciar em outros tipos celulares. Todas essas características demonstram que os condroprogenitores são, na verdade, células-tronco. A descoberta de um nicho de células-tronco na epífise é animadora, pois a presença de tais nichos já havia sido demonstrada em outros tecidos que apresentam uma necessidade de regeneração contínua, como a pele, o sangue e o intestino, mas nunca havia sido demonstrada nos ossos.

Em resumo, um nicho de células-tronco se forma após o nascimento na placa de crescimento dos ossos longos. Esse nicho facilita a auto-renovação dos condroprogenitores e possibilita que haja um contínuo suprimento de condrócitos para o crescimento dos ossos (Figura 6). O conhecimento desse nicho e de como as células agem permitindo o crescimento ósseo nos auxilia no entendimento do processo de formação de nosso esqueleto, mas também pode ser usado para entender como doenças se originam. É importante ressaltar que esse estudo foi conduzido em camundongos, e ainda não é claro se esses mecanismos são conservados em humanos. Caso isso seja confirmado, estudos futuros podem focar em estratégias para modular o crescimento ósseo, incluindo exercícios físicos, dietas e administração de moléculas que podem auxiliar no tratamento de crianças com desordens de crescimento.

Figure5

Figura 6: Resumo ilustrativo dos mecanismos de crescimento dos ossos longos com o passar do tempo. Durante o período fetal e neonatal, diferentes células da zona de reserva são recrutadas para a zona proliferativa, levando ao crescimento ósseo. Após a formação do COS, células de reserva diminuem e os condroprogenitores restantes adquirem a capacidade de auto-renovação, assim como outras características de células-tronco (sc). Essas células-tronco por sua vez, passam a ser responsáveis pelo crescimento longitudinal dos ossos.

Anúncios
0

Organoides: os “miniórgãos” criados em laboratório.

Você já ouviu falar nos “miniórgãos”? Também chamados de organoides, essas estruturas estão sendo bastante estudadas atualmente, e não é de se espantar! Os organóides são estruturas tridimensionais originadas a partir de células-tronco ou células progenitoras (células com seu potencial de diferenciação completo e células já no início do processo de diferenciação em um tipo celular específico) e que se assemelham a um tecido original específico. Para que essas células se rearranjem corretamente e deem origem a um organóide cerebral ou intestinal, por exemplo, algumas especificidades serão atendidas durante a sua produção. Apesar de sua produção ainda ser estudada e aprimorada, muitos modelos organoides já estão sendo utilizados na pesquisa científica em busca de resultados que sejam fisiologicamente semelhantes a órgãos in vivo (ou seja, em um organismo vivo e funcional).

Modelos de intestino, estômago, pâncreas, fígado, próstata e cérebro já são utilizados em trabalhos que buscam respostas em relação a diversas doenças relacionadas a estes órgãos, além de serem modelos eficientes para estudos na área da medicina regenerativa (para saber mais sobre a medicina regenerativa clique aqui). Recentemente, a Dra. Patrícia Pestana Garcez, o Dr. Steves Rehen e sua equipe na UFRJ demonstraram a relação entre a microcefalia e o vírus da zika a partir de organoides cerebrais, os “minicérebros”. Com a utilização de organoides, as pesquisas zika-microcefalia continuam ativas buscando compreender o máximo desta relação e, consequentemente, encontrar soluções sempre que possível (para saber mais sobre o vírus Zika, clique aqui). Na Keio University, no Japão, o pesquisador Toshi Sato produziu germes dentários (estrutura embrionária que dá origem ao dente) a partir de organoides formados pelo conjunto de células-tronco mesenquimais e epiteliais e os implantaram em camundongos. A partir dos implantes, um novo dente foi eficientemente formado.

modelo-3d-cerebro

Fonte:  Sousa & Resende, Bio&Tecnologia, Neurociência, Saúde, 2014.

Os organoides são um modelo muito atrativo, já que tem potencial para se assemelhar ao local de interesse de uma determinada área de estudo. Assim, as respostas observadas nas experimentações em laboratório serão mais próximas da realidade, o que é especialmente importante se o interesse da pesquisa é encontrar respostas e melhor compreender doenças, suas relações com fatores externos ou mesmo testes farmacológicos.

 

Referências

https://cientistasdescobriramque.com/2017/05/16/organoides-muito-mais-que-apenas-orgaos-em-miniatura/

Yin, X. et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell, 2015.

Sousa & Resende MODELO TRIDIMENSIONAL DE CÉREBRO HUMANO PARA ESTUDO DE DOENÇAS NEURODEGENERAGIVAS. Bio&Tecnologia, Neurociência, Saúde, 2014.

http://ciencia.estadao.com.br/blogs/herton-escobar/cientistas-brasileiros-mostram-que-zika-pode-matar-celulas-neuronais/

1

Células-tronco geneticamente modificadas: um novo tratamento para doenças inflamatórias?

Quem nunca sentiu dor, vermelhidão e aumento de temperatura após fazer um piercing, ralar os joelhos, ou até mesmo se cortar com uma folha de papel? Esses e outros danos aos nossos tecidos desencadeiam o que é chamado de inflamação. A inflamação é um processo natural e muitas vezes necessário para reestabelecer o bom funcionamento de órgãos e tecidos. Em alguns casos, ainda não muito bem compreendidos, devido a um mal funcionamento de nosso organismo, ocorre uma resposta inflamatória descontrolada e prolongada, denominada de inflamação crônica (explicação mais completa sobre inflamação nesse link). Esse processo pode ser acompanhado pela destruição dos tecidos e órgãos afetados, causando doenças severas como câncer, artrite e diabetes.

A artrite reumatoide é uma doença inflamatória crônica caracterizada por inflamações nas articulações. Seus sintomas variam de inchaço até extrema dor e perda de movimentos. Dependendo do avanço da doença, até mesmo cirurgias podem ser necessárias para substituição de articulações! Apesar de atingir cerca de 9,7 milhões de pessoas no mundo (dados de 2010), não há, ainda, uma cura para artrite reumatoide; apenas métodos de combate a seus sintomas.

Uma das dificuldades na criação de tratamentos para doenças crônicas está no fato de que nem todos os fatores envolvidos no desenvolvimento dessas doenças são conhecidos. Entretanto, sabe-se que moléculas chamadas citocinas  como IL-1 e TNF-α estão desreguladas nesse processo. Citocinas são moléculas produzidas por células específicas (por exemplo macrófagos e linfócitos) em reposta a organismos invasores como vírus e bactérias. Essas moléculas têm funções diversas incluindo: estimular macrófagos e células NK no combate a infecções; ativar a células produtoras de anticorpos; atrair células inflamatórias para zonas de infecção, entre outros. Em resumo, citocinas são produzidas durante processos infecciosos para auxiliar o organismo a retornar ao seu equilíbrio. A produção de citocinas normalmente dura de poucas horas a alguns dias, enquanto houver um estímulo, porém em doenças inflamatórias crônicas essa produção é desregulada e prolongada, levando a níveis inflamatórios exacerbados.

Tratamentos baseados na inibição de citocinas, visando diminuir processos inflamatórios tem sido utilizado em pacientes com artrite. Porém, apesar de serem efetivos em diminuir a resposta inflamatória, esses tratamentos não são efetivos para todos os pacientes, tem efeitos colaterais muitas vezes não conhecidos e são aplicados de forma sistêmica (através de injeções intravenosas e subcutâneas e não apenas nas articulações). A aplicação sistêmica de inibidores de citocinas inflamatórias tende a interferir com o sistema imune dos pacientes deixando-os susceptíveis a infecções, e até mesmo a outras doenças autoimunes.

Em busca de novos tratamentos para doenças inflamatórias crônicas como a artrite reumatoide, um estudo recente publicado no jornal Stem Cell Reports modificou geneticamente células tronco retiradas de camundongos para que elas produzissem moléculas anti-inflamatórias (Brunger et al. 2017). Mais especificamente, os cientistas envolvidos nessa publicação retiraram células adultas da pele de camundongos e as transformaram em células tronco pluripotentes induzidas – iPSCs (a descoberta de como gerar essas células rendeu um prêmio nobel para John B. Gurdon e Shinya Yamanaka em 2012!!). As iPSCs foram então modificadas geneticamente utilizando-se um sistema  de manipulação altamente eficiente e específico chamado de CRISPR/Cas9  (já descrito aqui na nossa seção de biociências do blog).

Após modificadas, as iPSCs passaram a produzir moléculas anti-inflamatórias em resposta a citocinas inflamatórias (IL-1 e TNF-α), o mesmo efeito esperado dod medicamentos utilizados de forma sistêmica. Essas células-tronco geneticamente modificadas e que respondem aos estímulos externos foram denominadas de células inteligentes ou “SMART” (Sigla em inglês para “células-tronco modificadas para terapias regenerativas autônomas”). Um vídeo explicativo (em inglês) sobre a criação e funcionamento dessas células pode ser encontrado clicando aqui.

Esse tipo de tratamento se mostra bastante inovador, uma vez que as “SMART” têm a capacidade de perceber a quantidade de citocinas inflamatórias no meio extracelular e produzir moléculas anti-inflamatórias em quantidades proporcionais aos níveis de inflamação. O combate à inflamação de uma maneira regulada é extremamente importante, pois a inflamação é um evento essencial para processos biológicos básicos como combate a infecções e reparo tecidual.

Após demonstrarem que as “SMART” possuem ação anti-inflamatória, os autores ainda diferenciaram essas células-tronco em tecido cartilaginoso in vitro. Quando tratada com citocinas inflamatórias, a cartilagem derivada de células normais (não modificadas para produção de anti-inflamatórios) apresentou alto grau de inflamação e degradação. A cartilagem criada a partir das “SMART” (produtoras de moléculas anti-inflamatórias), quando tratada com citocinas inflamatórias apresentou baixos níveis de inflamação e degradação tecidual. Isso sugere que as células-tronco modificadas, poderiam ser diferenciadas em cartilagem e aplicadas em pacientes com artrite, substituindo regiões degradas pela doença e conferindo proteção contra novas degradações causadas pela inflamação crônica.

Apesar de ser um tratamento inovador e promissor, essas injeções estão ainda na fase de testes em camundongos. A aplicação de células-tronco em humanos passa por várias discussões éticas, e necessita de teste pré-clínicos e clínicos para sua utilização como um real medicamento. Também é importante ressaltar que as células-tronco, quando injetadas sistematicamente, podem parar em locais não esperados, como pulmões, fígado e baço além de apresentarem baixa sobrevida in vivo. Ainda não há total compreensão de quais efeitos colaterais podem surgir com o acúmulo de células-tronco nos órgãos citados, porém, alguns experimentos com camundongos sugerem que a presença dessas células nos pulmões pode causar embolia pulmonar, enquanto que células-tronco acumuladas no fígado e baço poderiam contribuir para a diminuição da resposta inflamatória (uma revisão mais completa sobre esses pontos pode ser encontrada em diversos artigos científicos em inglês como em Eggenhofer e colaboradores e Kurtz) Desse modo, é de extrema importância ter um conhecimento mais profundo sobre a sobrevivência, migração e diferenciação das células SMART antes de sua aplicação clínica.

Referência

Brunger JM, Zutshi A, Willard VP, Gersbach CA, Guilak F. 2017. Genome Engineering of Stem Cells for Autonomously Regulated, Closed-Loop Delivery of Biologic Drugs. Stem cell reports 8:1202–1213.