0

CRISPR/Cas: A revolução do século está prestes a enfrentar seu maior desafio

O ano de 2012 foi o responsável por gerar, principalmente nos indivíduos que sofriam com doenças genéticas, uma grande esperança. As cientistas Emmanuelle Charpentier (https://pt.wikipedia.org/wiki/Emmanuelle_Charpentier) e Jennifer Doudna (https://pt.wikipedia.org/wiki/Jennifer_Doudna) propuseram uma técnica capaz de permitir aos humanos a capacidade de editar o DNA e corrigir erros no genoma humano, responsáveis por causarem doenças.

A técnica proposta é conhecida como CRISPR/Cas9 e é inspirada num mecanismo de defesa bacteriano (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/05/11/entenda-a-nova-arma-da-engenharia-genetica-crisprcas9-e-a-polemica-envolvida/).

Essa técnica, assim como outras duas famosas estratégias com o mesmo fim, é capaz de produzir quebra nas duas fitas do DNA no local para o qual foram destinadas pelo cientista.

No sistema CRISPR/Cas a enzima Cas provoca a quebra no DNA no local em que foi posicionada por uma molécula de RNA, o RNA guia (gRNA). Ele é desenhado pelo manipulador para direcionar a enzima para o local desejado no genoma para que a edição aconteça (Figura 1).

Para corrigir a região com um erro que cause doença, o corte deve ser dirigido pelo gRNA para o local do erro, e o manipulador deve também fornecer trecho de DNA com sequência correta para substituição do trecho errado. Se o desejo for apenas de que a região seja modificada por remoção de alguns pares de bases para impedir a função de algum gene (silenciá-lo), não é necessário fornecer o trecho de DNA citado; apenas a enzima e o RNA são requeridos neste caso.

Figura 1

Figura 1: Representação esquemática da ação da ferramenta de edição sítio-dirigida de genes conhecida como CRISPR/Cas para inserir sequência correta corrigindo erro no DNA. O gRNA encontra-se em amarelo e nuclease Cas (enzima) em vermelho. Modificado de https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975017300617?via%3Dihub.

Durante os anos de 2017 e 2018 este blog trouxe até vocês textos abordando diversos progressos científicos alcançados por meio desta tecnologia de edição (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/10/30/trigo-sem-gluten-e-possivel-estamos-chegando-la/ ; https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/08/16/o-primeiro-embriao-humano-corrigido/ ; https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/06/14/celulas-tronco-geneticamente-modificadas-um-novo-tratamento-para-doencas-inflamatorias/ ) e de tecnologias de mesma finalidade (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2018/07/04/a-era-da-edicao-de-genes-humanos-para-curar-doencas-comecou/ ).

No entanto, o grande desafio para provar que a metodologia é segura e pode realmente revolucionar a medicina está se iniciando. Doze pacientes que sofrem com anemia falciforme ou beta-talassemia participarão, até 2022, de um estudo clínico na Europa que utilizará CRISPR/Cas visando a correção do DNA dos pacientes (https://www.clinicaltrialsregister.eu/ctr-search/trial/2017-003351-38/DE).

Na Alemanha também serão realizados ensaios semelhantes por empresas com sede nos Estados Unidos: em Boston (Vertex Pharmaceuticals) e em Massachusetts (CRISPR Therapeutics).

Talassemia e anemia falciforme

Ambas as doenças estão relacionadas com produção anormal de hemoglobina: a principal proteína que existe dentro das células vermelhas do sangue e que é responsável pelo transporte de oxigênio em nosso organismo. Essa proteína no humano adulto deve possuir 4 unidades formadoras (subunidades): duas alfa e duas beta (Figura 2), uma configuração diferente da hemoglobina existente no feto (que contém duas cadeias alfa e duas gama).

Figura 2

Figura 2: Estrutura tridimensional da proteína hemoglobina humana do adulto. Fonte: PDB – 1GZX.

Nas talassemias, diferentes mutações no DNA podem levar à produção de formas erradas da subunidade alfa (alfa-talassemia) ou da subunidade beta (beta-talassemia) em diferentes proporções, acarretando diferentes graus de comprometimento da saúde do paciente (http://bvsms.saude.gov.br/bvs/folder/talassemias_folder.pdf).

Em casos mais graves o paciente pode inclusive necessitar receber transfusões de sangue para manter-se vivo.

Na anemia falciforme, (http://www.abhh.org.br/imprensa/7-verdades-sobre-anemia-falciforme/) a mutação no DNA acarreta produção de subunidade beta com defeito, que leva as células vermelhas (hemácias) a adotarem o formato de foice (Figura 3), comprometendo o transporte de oxigênio. O paciente pode sofrer com obstruções de vasos de pequeno calibre por estas células e a anemia decorrente da destruição destas células de formato atípico também pode torná-los mais propensos a infecções.

Figura 3

Figura 3: Hemácia normal e hemácia com forma de foice da anemia falciforme. Fonte: http://sites.uem.br/drgenetica/hematologia-clinica/hemoglobinopatias/anemia-falciforme

 

Terapias utilizando CRISPR/Cas

Estas terapias dos ensaios clínicos consistem em remover células-alvo dos pacientes, editar o DNA destas em laboratório e devolvê-las aos pacientes de doenças causadas por erros no genoma. Desta forma espera-se melhora no quadro do paciente, e em alguns casos, futuramente, sua cura.

O estudo das empresas americanas consiste em obter de 12 pacientes entre 18 e 35 anos que sofram de beta-talassemia e sejam dependentes de transfusão, células-tronco responsáveis pela geração de células do sangue, conhecidas como HSPCs. Em laboratório visa-se utilizar o sistema CRISPR/Cas para editar região regulatória do gene BCL11A e posteriormente devolver ao paciente, via um cateter venoso central, as células modificadas (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03655678 ).

BCL11A está relacionado a impedir a produção de hemoglobina fetal a partir de cerca de 3 meses de idade para a produção de hemoglobinas ser apenas da versão adulta. Se este gene for silenciado, no entanto, espera-se que a produção de hemoglobina fetal possa ocorrer nos pacientes, reduzindo-se os sintomas da beta-talasssemia: visto que os pacientes poderão produzir hemoglobina fetal (que não tem cadeias beta – sítio da mutação que assola os pacientes) para realizar o transporte de oxigênio em seus organismos.

Toda a comunidade científica aguarda ansiosa pelos resultados que poderão tornar a grande promessa de cura de doenças genética através da técnica CRISPR/Cas uma realidade, postergar um pouco mais esta almejada realidade para que ajustes na técnica sejam feitos, ou invalidar este sonho.

Anúncios
1

Uma ciência chamada Farmacogenética: por que o remédio que funciona para vizinha não é o certo para você.

Quem nunca ouviu a indicação, de um amigo ou parente, de um remédio milagroso que para ele foi “tiro e queda”, a solução de todos os problemas? Quem não conseguiu se adaptar a um medicamento referência, aquele famoso de marca, mas que para você não deu certo? Por que para a minha dor de cabeça é melhor o paracetamol e para a sua o ácido acetilsalicílico? Essas questões, chamadas de variabilidade individual de resposta, dão origem aos muitos problemas da automedicação e da prescrição empírica, e causam inúmeras intoxicações medicamentosas todos os anos. A automedicação é o uso sem prescrição médica de fármacos comprados por conta própria, e é um problema de saúde pública no Brasil, que corresponde a 35% do uso de medicamentos no país.Já a prescrição empírica é a forma utilizada pelo médico para acertar o medicamento ao paciente, em um método de tentativa e erro, por isso, até acertar o medicamento certo para o paciente, ele pode passar por vários ajustes de prescrições e de doses. Isso é muito comum na prescrição de estatinas, anticoagulantes, anticonvulsivos e antidepressivos.

A prescrição empírica resulta em vários riscos, o paciente, cansado de tentativas, tende a ter menor adesão ao tratamento, são feitos gastos desnecessários com medicações, leva-se mais tempo até o controle dos sintomas ou da doença podendo causar agravos maiores ou desencadear efeitos adversos graves. Imagine que maravilha seria determinar o fármaco “certo” para cada paciente, a individualização da terapia! E ainda saber isso, antes da prescrição? Bom, já pensaram nisso, e a ciência que investiga essas variações chama-se Farmacogenética. Entre os diversos fatores que interferem na ação de um medicamento, estão aqueles ligados ao paciente, e nenhuma pessoa é exatamente igual à outra, o que pode explicar essa variabilidade.

A farmacogenética investiga variantes genéticas em cada indivíduo que determinam seu perfil de resposta, podendo prever quem irá responder melhor, quem não irá responder ou aqueles grupos de pessoas com alto risco de efeitos adversos ou falha do tratamento. Os alvos de estudos são os chamados polimorfismos genéticos, que ocorrem de forma aleatória no nosso genoma, sendo os mais comuns: deleção, inserção ou substituição de uma base única (SNP – single nucleotide polimorphysm) e a variação do número de sequências repetitivas de micro e minissatélites, como os STR (short tandem repetitive sequences). Esses polimorfismos podem alterar a estrutura da proteína que irão traduzir e resultar em alterações da sua função, causando, por isso, as diferenças de resposta entre as pessoas a um mesmo fármaco.

Para quem quiser ler um pouquinho mais sobre essas variantes, fica a dica do texto da Bruna Paola, aqui do Blog, que escreveu sobre predisposição genética, no link:Predisposição genética: destino ou fator modificável?

Esses polimorfismos são estudados em genes que codificam proteínas importantes para o metabolismo dos fármacos, como transportadores, proteínas do metabolismo e receptores para os mesmos. Um grupo de proteínas amplamente estudadas são as enzimas do citocromo P450, de grande importância na farmacologia, pois são responsáveis pela metabolização da maioria das substâncias endógenas e exógenas (como os fármacos), e alvos de muitos estudos farmacogenéticos. O estudo do citocromo P450 já permitiu identificar perfis de metabolizadores lentos, intermediários e rápidos, que eliminam substâncias de seu organismo com velocidades diferentes. Os metabolizadores lentos estão associados com acúmulo do fármaco no organismo e ocorrência de efeitos adversos, enquanto que os metabolizadores rápidos, comumente, não são beneficiados com o tratamento, já que eliminam o medicamento muito rápido, antes mesmo do seu efeito.

farmacogenetica_f8

Imagem disponível em http://www.moreirajr.com.br/revistas.asp?fase=r003&id_materia=6105

Um dos entraves para o uso dos testes farmacogenéticos na rotina clínica é o custo ($$$!!!). Existem inúmeras (centenas, milhares!) variáveis genéticas que influenciam na resposta farmacêutica de diferentes fármacos, e é preciso determinar quais são as mais relevantes. Além disso, todos esses métodos se apoiam em ferramentas de biologia molecular que também possuem um custo elevado, ainda mais, quando trabalhamos com kits comerciais (vendidos prontos). Os laboratórios diagnósticos no nosso país tendem a torcer o nariz para a biologia molecular, porque ela é cara, porém seus benefícios são muitos, e se formos colocar na ponta do lápis, seria bem econômico evitarmos intoxicações medicamentosas, não acha? Quantos medicamentos são perdidos nessa prescrição empírica? Por isso é muito importante o estudo e divulgação de protocolos de testes farmacogenéticos, formando painéis de análises, ou seja, um grupo de variantes que nos permite avaliar uma resposta do paciente antes mesmo que ele use o medicamento.

Jens Borggaard Larsem e Jan Borg Rasmussem, de um grupo de pesquisa sobre epilepsia na Dinamarca, publicaram em abril deste ano um artigo na revista “Pharmacogenomics and Personalized Medicine” no qual apresentam seus resultados no desenvolvimento de painéis de testes, por PCR, para variantes nos genes CYP2D6 e CYP2C19,de importância reconhecida no tratamento de epilepsia. Esses genes codificam enzimas do citocromo P450, o grande metabolizador de fármacos e substâncias endógenas do nosso organismo, e por isso são de grande importância em vários tratamentos. O objetivo do estudo era demonstrar que desenvolver metodologias “in house” (reagentes preparados no seu próprio laboratório) pode diminuir significativamente os custos comparados aos kits comerciais, e apresentar um resultado tão confiável quanto! Mas para isso deve-se seguir um protocolo muito rigoroso. O laboratório de pesquisa – Laboratory Unit Of the Danish Epilepsy Centre – trabalha desde 2002 com essas variantes genéticas, recebendo em média 300 amostras para análise por ano, com essas amostras os pesquisadores compararam os resultados obtidos por um método de referência, também chamado de padrão ouro, com outras técnicas mais acessíveis.

A maioria dos testes farmacogenéticos é realizado por PCR (Polymerase Reaction Chain), um teste de grande sensibilidade, especificidade, e que tem a vantagem de poder ser desenhado e adaptado no próprio laboratório. Uma das etapas mais importantes do desenvolvimento de testes de PCR in house é o desenho dos primers, pequenas sequências de DNA que irão demarcar qual segmento deve ser amplificado, depois disso devemos otimizar o ensaio, testando várias concentrações dos ingredientes, e principalmente, dos primers, para que a reação funcione. Como em um bolo, temos que seguir a receita a risca, pois a falta de primers vai diminuir a eficiência da reação, enquanto que o excesso do mesmo vai gerar produtos inespecíficos, “sujando” os resultados. Por último, o teste desenvolvido e funcional deve ser validado, isso quer dizer que deve-se comparar os resultados do teste in house com metodologias de referência, para provar que o teste desenvolvido realmente funciona.

Jens Borggaard Larsem e Jan Borg Rasmussem, 2017, fizeram todas essas etapas, e desenvolveram dois testes in house, baseados na metadologia de PCR, para variantes nos genes CYP2D6 e CYP2C19, de importância clínica no tratamento da epilepsia, que foram validados em sua rotina clínica. O teste desenvolvido pelos pesquisadores permite analisar seis variantes no gene CYP2D6 e outras três no gene CYP2C19, permitindo a leitura de até 96 amostras em uma hora. Os testes foram comparados com ensaios de PCR em tempo real (sondas Taqman), e ensaios por RFLP e Sequenciamento, utilizando kits comerciais e demonstraram que o teste in house apresenta resultados iguais ou superiores aos kits comerciais, no que se refere ao custo-benefício, sensibilidade e o tempo gasto nas análises.

Para saber mais informações sobre a técnica de PCR, você pode acessar: UFMG – Descrição da PCR ou Khan Academy (PCR)

Estudos como estes mostram a importância da pesquisa atrelada ao diagnóstico, claro que existem testes prontos, já encaixotados com todos os reagentes necessários, em suas quantidades e proporções corretas, os “kits comerciais”, mas quanto você paga por essa praticidade? Um teste elaborado in house é mais barato, ele é pensado na rotina do seu laboratório, isso quer dizer que você pode produzir reagentes em quantidade suficiente para a sua rotina, evitando desperdício e reduzindo ainda mais o custo ,sem falar na vantagem de desenvolver um ensaio baseado na sua população-alvo, que procure as variantes mais comuns na região e não aquelas encontradas no país de uma grande marca. Claro que esse processo precisa ser rigorosamente validado, obedecendo padrões de qualidade, possuindo controles internos e externos para garantir a fidedignidade do seu resultado. Alternativas para a redução dos custos dos testes de perfis genéticos, como os testes in house, são importantes para que mais pessoas possam usufruir dos benefícios desses avanços científicos. Do ponto de vista científico, seria muito positivo que mais grupos divulgassem seus resultados e o passo-a-passo realizado, assim como Larsem e Rasmussem, para que outros laboratórios e pesquisadores possam utilizar esses dados como apoio para desenvolver seus próprios testes e difundir esse conhecimento, aumentando a confiabilidade dos testes in house.

Referências:

Larssem JB, Rasmussem, JB. Pharmocogenetic testing revisited: 5′ nuclease real-time polymerase chain reaction test panels for genotyping CYP2D6 and CYP2C19. Pharmacogenomics and Personalized Medicine 2017 Abr;10:115–28.

Plöthner M, Ribbentrop D, Hartman JP, Frank M. Cost-effectiveness of pharmacogenomic and pharmacogenetic test-guided personalized therapies: a systematic review of the approved active substances for personalized medicine in Germany. Adv Ther. 2016 Sep;33(9):1461-80.