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Erdafitinib: novo medicamento para tratamento do câncer de bexiga

No mês de abril deste ano de 2019 a agência norte-americana FDA aprovou em tramitação classificada como “Aprovação Acelerada” a utilização da substância Erdafitinib como medicamento para tratar o câncer de bexiga avançado ou metastático (https://www.drugs.com/history/balversa.html). 

O câncer de bexiga

O câncer de bexiga (Figura 1) é o 6º mais frequente entre homens e o 19º entre as mulheres em países desenvolvidos e em 2018 foi estimado no Brasil o aumento de 6.690 novos casos entre os homens e 2.790 entre as mulheres (https://www.inca.gov.br/tipos-de-cancer/cancer-de-bexiga).

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Figura 1: Tomografia computadorizada de paciente com câncer de bexiga. A seta indica parede da bexiga espessada como consequência da doença. Reproduzida de: cancer.gov/news-events/cancer-currents-blog/2017/approvals-fda-checkpoint-bladder com créditos a: Wikimedia Commons, CC-BY-SA-4.0

Além do avançar da idade, se destacam como fatores que potencializam o risco de desenvolvimento da doença: o hábito do tabagismo (principal fator) e exposição prolongada a substâncias nocivas como agrotóxicos, petróleo, tintas, dentre outras (https://www.inca.gov.br/tipos-de-cancer/cancer-de-bexiga).

Radioterapia, quimioterapia e intervenções cirúrgicas estão entre as opções de tratamento que são escolhidas a depender do grau de evolução do quadro do paciente. No entanto, mesmo após terapia existem pacientes que voltam a apresentar o câncer, e 1 a cada 5 destes possui alterações na sequência de DNA que é responsável por codificar diferentes formas de uma proteína receptora conhecida como FGFR: receptor do fator de crescimento de fibroblastos (http://medicsupply.net/cancer-de-bexiga-metastatico/).

FGFRs participam da sinalização de processos muitos importantes para as células como divisão celular, diferenciação celular e formação de vasos sanguíneos (https://ghr.nlm.nih.gov/gene/FGFR2 e https://ghr.nlm.nih.gov/gene/FGFR3) (Figura 2). Logo, com alterações nestas proteínas é possível o desencadear de grandes prejuízos ao organismo como: divisão celular descontrolada, prejuízos à diferenciação de células e formação disseminada de vasos sanguíneos – todas importantes etapas para o desenvolvimento e progressão de tumores.

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Figura 2: Estrutura de receptor FGFR (destacado com asterisco vermelho assim como seu ligante FGF) e diversas proteínas e vias de sinalização desencadeada a partir do mesmo. A desregulação dessas vias de receptores das formas 2 e 3 ocorre em pacientes com câncer de bexiga que são susceptíveis ao tratamento com o novo medicamento.  Traduzida de: https://clincancerres.aacrjournals.org/content/21/12/2684

As formas 2 e 3 de FGFR (FGFR2 e FGFR3, respectivamente) contendo alterações capazes de levarem a efeitos prejudiciais no organismo estão intimamente envolvidas com o câncer de bexiga avançado ou metastático (com alta probabilidade de levar à formação de tumores secundários em outras regiões do organismo) e com a reincidência deste após terapias convencionais (https://www.jnj.com/balversa-erdafitinib-receives-u-s-fda-approval-for-the-treatment-of-patients-with-locally-advanced-or-metastatic-urothelial-carcinoma-with-certain-fgfr-genetic-alterations). 

 

O Erdafitinib 

O fármaco, que é comercializado nos Estados Unidos sob o nome Balversa (Figura 3),  foi desenvolvido para utilização especialmente em pacientes com câncer de bexiga apresentando alterações genéticas em FGFR2 e/ou FGFR3. Trata-se de um medicamento alvo-específico e o primeiro inibidor de FGFRs aprovado pela FDA para uso em seres humanos (https://www.centerwatch.com/drug-information/fda-approved-drugs/drug/100375/balversa-erdafitinib).

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Figura 3: Erdafitinib.

A aprovação foi realizada de modo acelerado pela agência norte-americana visto que a ela é permitido aprovar medicamentos rapidamente visando tratar doenças graves para as quais ainda não há terapia eficaz, como é o caso do câncer de bexiga avançado ou metastático.

O medicamento, da farmacêutica Janssen, ofereceu ação satisfatória em ensaio realizado junto a 87 pacientes que manifestavam a doença. Alguns destes pacientes que não haviam respondido a tratamento anterior (conhecido como terapia anti PD-L1/PD-1) responderam ao novo fármaco. Dos 87 pacientes 2,3% apresentaram resposta completa ao Erdafitinib e 30% apresentaram resposta parcial como, por exemplo, redução de tamanho do tumor (https://www.drugs.com/newdrugs/fda-approves-balversa-erdafitinib-metastatic-bladder-cancer-4948.html).

A estratégia terapêutica adotada consistiu na ingestão por via oral de um comprimido diário do medicamento e os efeitos colaterais mais preocupantes foram desordens oculares, hiperfosfatemia e toxicidade embrio-fetal. Especial atenção deve ser dada a estes aspectos pelo médico que acompanha o tratamento.

Em um novo estudo realizado nos EUA e publicado este ano, 99 pacientes com tratamentos anteriores que falharam ao deter a progressão do câncer foram tratados com o novo fármaco. Destes, 3% responderam de forma completa ao medicamento e 37% de forma parcial. Entre o grupo de pacientes previamente tratados por imunoterapia os resultados foram otimizados, com resposta de 59%. Os efeitos colaterais mencionados previamente se fizeram presentes em 46% dos pacientes, mas apenas 13% abandonaram o estudo por esta razão (https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1817323).

Os médicos oncologistas brasileiros ainda não podem contar com a utilização deste medicamento em estratégias terapêuticas de seus pacientes visto que a aprovação pela ANVISA ainda não ocorreu, mas a inserção deste na prática clínica nos EUA é um importante passo para que isso venha a ser possível também em território nacional num futuro próximo (https://www.oncologiabrasil.com.br/biomarcadores-e-sua-importancia-para-o-diagnostico-e-tratamento-de-tumores-genitourinarios/).

 

Referências

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Nova estratégia para tratar hipertensão portal a caminho?

Já foi abordado neste blog a utilização de antigos fármacos para tratar novas doenças (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2019/04/03/eu-estava-aqui-o-tempo-todo-e-so-voce-nao-viu-quando-velhos-remedios-tratam-novas-doencas/) ou para tratar doenças que já existem há algum tempo mas são diferentes daquelas para qual o medicamento foi originalmente desenvolvido (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2019/ 05/01/batalha-contra-a-doenca-de-alzheimer-uma-nova-esperanca-na-forma-de-coquetel-de-moleculas-terapeuticas/). Este texto tem o objetivo de destacar a possibilidade de utilização do fármaco Sivelestat, um inibidor da enzima elastase de neutrófilos e mais comumente usado para tratar insuficiência respiratória aguda, para tratamento de hipertensão portal.

 

A hipertensão portal consiste na elevação de pressão na veia porta hepática (ou mais comumente chamada veia porta – Figura 1), responsável por drenar o sangue das glândulas associadas ao sistema digestivo e do sistema digestivo para o fígado (http://www.sobrice.org.br/paciente/condicoes-clinicas/hipertensao-porta).

 

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Figura 1: Fígado e vasos importantes envolvidos em sua circulação. A veia porta pode ser visualizada na imagem.

As causas mais comuns de hipertensão portal são doenças crônicas do fígado, formação de coágulos ou outras alterações vasculares em veias circundantes, ou ainda em regiões endêmicas de esquistossomíases ou esquistossomoses. Para os pacientes, as consequências são severas e há grande ameaça à vida destes com possibilidade de evolução para hemorragia, inchaço da cavidade abdominal por acumulação de fluidos, comprometimento de função cerebral, etc (https://www.msdmanuals.com/pt-br/profissional/dist%C3%BArbios-hep%C3%A1ticos-e-biliares/abordagem-ao-paciente-com-doen%C3%A7a-hep%C3%A1tica/hipertens%C3%A3o-portal). Apenas em 2015 ocorreram no Brasil 28337 mortes devido a cirrose, câncer hepático e transtornos por uso de álcool (http://www.scielo.br/pdf/rbepid/v20s1/1980-5497-rbepid-20-s1-00061.pdf).

Os tratamentos para o problema envolvem opções limitadas que contemplam técnicas invasivas como endoscopias seriadas, associadas ou não, ao uso de medicamentos que ajudem no controle de pressão.

Uma pesquisa desenvolvida recentemente nos EUA por pesquisadores da Mayo Clinic liderados por Vijay Shah, no entanto, tem o potencial de mudar esta situação no futuro. O medicamento Sivelestat foi capaz de diminuir a hipertensão portal em modelos de camundongos usados no estudo, e os resultados obtidos pelos pesquisadores também se mostraram promissores em amostras de fígados humanos.

Os pesquisadores perceberam que um importante fator para a hipertensão portal ocorrer é a formação de coágulos e que as células do sangue conhecidas como neutrófilos têm importante papel no desenvolver do quadro.

O fármaco, ao inibir a função de uma enzima do neutrófilo (elastase) relacionada à formação dos coágulos, contribuiu para que a hipertensão portal fosse diminuída nos animais.

Camundongos nos quais foi induzida a hipertensão portal congestiva foram tratados com injeções de Sivelestat três vezes na semana durante seis semanas, e ao final do tratamento apresentaram não só menos formação de fibrina e outros componentes associados a coágulos, mas também redução de pressão portal (Figura 2).

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Figura 2: O tratamento de animais de experimentação com Sivelestat reduziu não apenas a produção de fibrina (a e b), mas também como consequência a pressão portal. Adaptada de (https://doi.org/10.1053/j.gastro.2019.03.013).

A partir dos resultados encontrados no trabalho, incluindo a compreensão do envolvimento de trombos no quadro de hipertensão portal e a possibilidade de se atenuar os sintomas com Sinvelestat, abrem-se novas possibilidades para o desenvolvimento de novos medicamentos para tratar esta enfermidade que pode levar a óbito.

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Batalha contra a Doença de Alzheimer: uma nova esperança na forma de coquetel de moléculas terapêuticas

A Doença de Alzheimer já foi abordada neste blog em diversas ocasiões (https://cientistasfeministas.wordpress.com/?s=alzheimer) e continua a desafiar cientistas na busca por novas opções de diagnóstico e tratamento.

Em janeiro deste ano foi publicado trabalho desenvolvido por cientistas norte americanos que utilizaram um coquetel de moléculas terapêuticas sintéticas para tratar a Doença de Alzheimer (DA), e obtiveram melhora significativa no quadro de animais de experimentação em fases iniciais da doença, com reestabelecimento de memória (https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S2211-1247%2818%2931932-6).

A DA foi descrita pelo psiquiatra e neuroanatomista Alois Alzheimer em 1906 durante uma palestra (http://www.ghente.org/ciencia/genetica/alzheimer.htm). Os pacientes apresentam desorientação e perda de memória e de locomoção progressivos, além dos demais sintomas de demência: como estados vegetativos temporários (evoluindo para permanentes) e morte (http://portalms.saude.gov.br/saude-de-a-z/alzheimer).

Os achados principais no cérebro desses pacientes são depósitos de placas amiloides no meio extracelular e emaranhados neurofibrilares (ricos em proteína Tau fosforilada – http://ggaging.com/export-pdf/191/v6n3a07.pdf) no meio intracelular.  A associação de peptídeos beta-amiloide (Figura 1) a proteínas príon (http://www.revistaseletronicas.fmu.br/index.php/ACIS/article/download/580/702) desencadeia o acumular tóxico destas placas e induz resposta do sistema imune, que em conjunto acabam por causar a morte de neurônios e perda de comunicação entre estes na forma de sinapses (http://abraz.org.br/web/sobre-alzheimer/atualizacoes-cientificas/).

FIGURA 1

Figura 1: Peptídeo beta-amiloide (PDB 2LFM).

Após os cientistas, liderados pelo professor Stephen Strittmatter, testarem um grande número de compostos, um antigo antibiótico se mostrou promissor (leia também o texto sobre antigos fármacos para tratar novas doenças https://cientistasfeministas.wordpress.com/2019/04/03/eu-estava-aqui-o-tempo-todo-e-so-voce-nao-viu-quando-velhos-remedios-tratam-novas-doencas/) após ser decomposto para formar um polímero. Alguns outros polímeros também se mostraram capazes de passar pela barreira hemato-encefálica e exibir o efeito desejado.

Foram analisados 2560 fármacos e mais 10130 moléculas pequenas diversas e a cefalosporina Cefixime se mostrou inibitória. No entanto, no re-teste se percebeu que não era a forma natural do antibiótico que exibia a ação, e sim sua forma decomposta (obtida após incubação em DMSO a 23ºC por 6 dias). A forma degradada de Ceftazidime, outra cefalosporina, também exibiu atividade de inibir a associação de proteínas príon e peptídeos beta-amiloide.  

Os cientistas identificaram ainda polímeros de carga negativa capazes de interação específica com proteínas príon, como o polímero sintético poli [ácido 4-estireno sulfônico-ácido co-maleico] – PSCMA.

O coquetel de compostos poliméricos foi então dissolvido e ofertado a camundongos modelo para a Doença de Alzheimer, provocando reparo das sinapses e recuperação de memória.

Em um dos experimentos, os cientistas analisaram cortes de hipocampo dos animais para verificar a comunicação entre os neurônios (sinapses). A proteína SV2a é um marcador eficiente presente nos neurônios pré-sinápticos e nos animais que não sofrem de DA (WT), os níveis se mostraram antes do tratamento, maiores que o dos animais modelo de Alzheimer (TG) (Figura 2A e Figura 2C – sem polímero), devido a estes últimos sofrerem, como esperado, com perda de sinapses pela doença. No entanto, após tratamento com PSCMA por 30 dias (2 vezes ao dia), os animais modelo para a doença (TG) alcançaram o padrão de presença do marcador equivalente ao dos animais saudáveis (WT) (Figura 2B e Figura 2C – com polímero).

FIGURA 2

Figura 2: Recorte e adaptação da Figura 7 do trabalho de Strittmatter e colaboradores, 2019 (https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S2211-1247%2818%2931932-6) evidenciando como o tratamento com PSCMA pode recuperar os níveis de SV2a em neurônios pré-sinápticos de camundongos modelo de DA.

Os resultados são animadores para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para o Alzheimer em fases iniciais. Os pesquisadores se dedicam atualmente aos testes para verificar se a formulação não é tóxica para utilização em humanos nos ensaios clínicos.

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CRISPR/Cas: A revolução do século está prestes a enfrentar seu maior desafio

O ano de 2012 foi o responsável por gerar, principalmente nos indivíduos que sofriam com doenças genéticas, uma grande esperança. As cientistas Emmanuelle Charpentier (https://pt.wikipedia.org/wiki/Emmanuelle_Charpentier) e Jennifer Doudna (https://pt.wikipedia.org/wiki/Jennifer_Doudna) propuseram uma técnica capaz de permitir aos humanos a capacidade de editar o DNA e corrigir erros no genoma humano, responsáveis por causarem doenças.

A técnica proposta é conhecida como CRISPR/Cas9 e é inspirada num mecanismo de defesa bacteriano (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/05/11/entenda-a-nova-arma-da-engenharia-genetica-crisprcas9-e-a-polemica-envolvida/).

Essa técnica, assim como outras duas famosas estratégias com o mesmo fim, é capaz de produzir quebra nas duas fitas do DNA no local para o qual foram destinadas pelo cientista.

No sistema CRISPR/Cas a enzima Cas provoca a quebra no DNA no local em que foi posicionada por uma molécula de RNA, o RNA guia (gRNA). Ele é desenhado pelo manipulador para direcionar a enzima para o local desejado no genoma para que a edição aconteça (Figura 1).

Para corrigir a região com um erro que cause doença, o corte deve ser dirigido pelo gRNA para o local do erro, e o manipulador deve também fornecer trecho de DNA com sequência correta para substituição do trecho errado. Se o desejo for apenas de que a região seja modificada por remoção de alguns pares de bases para impedir a função de algum gene (silenciá-lo), não é necessário fornecer o trecho de DNA citado; apenas a enzima e o RNA são requeridos neste caso.

Figura 1

Figura 1: Representação esquemática da ação da ferramenta de edição sítio-dirigida de genes conhecida como CRISPR/Cas para inserir sequência correta corrigindo erro no DNA. O gRNA encontra-se em amarelo e nuclease Cas (enzima) em vermelho. Modificado de https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975017300617?via%3Dihub.

Durante os anos de 2017 e 2018 este blog trouxe até vocês textos abordando diversos progressos científicos alcançados por meio desta tecnologia de edição (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/10/30/trigo-sem-gluten-e-possivel-estamos-chegando-la/ ; https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/08/16/o-primeiro-embriao-humano-corrigido/ ; https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/06/14/celulas-tronco-geneticamente-modificadas-um-novo-tratamento-para-doencas-inflamatorias/ ) e de tecnologias de mesma finalidade (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2018/07/04/a-era-da-edicao-de-genes-humanos-para-curar-doencas-comecou/ ).

No entanto, o grande desafio para provar que a metodologia é segura e pode realmente revolucionar a medicina está se iniciando. Doze pacientes que sofrem com anemia falciforme ou beta-talassemia participarão, até 2022, de um estudo clínico na Europa que utilizará CRISPR/Cas visando a correção do DNA dos pacientes (https://www.clinicaltrialsregister.eu/ctr-search/trial/2017-003351-38/DE).

Na Alemanha também serão realizados ensaios semelhantes por empresas com sede nos Estados Unidos: em Boston (Vertex Pharmaceuticals) e em Massachusetts (CRISPR Therapeutics).

Talassemia e anemia falciforme

Ambas as doenças estão relacionadas com produção anormal de hemoglobina: a principal proteína que existe dentro das células vermelhas do sangue e que é responsável pelo transporte de oxigênio em nosso organismo. Essa proteína no humano adulto deve possuir 4 unidades formadoras (subunidades): duas alfa e duas beta (Figura 2), uma configuração diferente da hemoglobina existente no feto (que contém duas cadeias alfa e duas gama).

Figura 2

Figura 2: Estrutura tridimensional da proteína hemoglobina humana do adulto. Fonte: PDB – 1GZX.

Nas talassemias, diferentes mutações no DNA podem levar à produção de formas erradas da subunidade alfa (alfa-talassemia) ou da subunidade beta (beta-talassemia) em diferentes proporções, acarretando diferentes graus de comprometimento da saúde do paciente (http://bvsms.saude.gov.br/bvs/folder/talassemias_folder.pdf).

Em casos mais graves o paciente pode inclusive necessitar receber transfusões de sangue para manter-se vivo.

Na anemia falciforme, (http://www.abhh.org.br/imprensa/7-verdades-sobre-anemia-falciforme/) a mutação no DNA acarreta produção de subunidade beta com defeito, que leva as células vermelhas (hemácias) a adotarem o formato de foice (Figura 3), comprometendo o transporte de oxigênio. O paciente pode sofrer com obstruções de vasos de pequeno calibre por estas células e a anemia decorrente da destruição destas células de formato atípico também pode torná-los mais propensos a infecções.

Figura 3

Figura 3: Hemácia normal e hemácia com forma de foice da anemia falciforme. Fonte: http://sites.uem.br/drgenetica/hematologia-clinica/hemoglobinopatias/anemia-falciforme

 

Terapias utilizando CRISPR/Cas

Estas terapias dos ensaios clínicos consistem em remover células-alvo dos pacientes, editar o DNA destas em laboratório e devolvê-las aos pacientes de doenças causadas por erros no genoma. Desta forma espera-se melhora no quadro do paciente, e em alguns casos, futuramente, sua cura.

O estudo das empresas americanas consiste em obter de 12 pacientes entre 18 e 35 anos que sofram de beta-talassemia e sejam dependentes de transfusão, células-tronco responsáveis pela geração de células do sangue, conhecidas como HSPCs. Em laboratório visa-se utilizar o sistema CRISPR/Cas para editar região regulatória do gene BCL11A e posteriormente devolver ao paciente, via um cateter venoso central, as células modificadas (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03655678 ).

BCL11A está relacionado a impedir a produção de hemoglobina fetal a partir de cerca de 3 meses de idade para a produção de hemoglobinas ser apenas da versão adulta. Se este gene for silenciado, no entanto, espera-se que a produção de hemoglobina fetal possa ocorrer nos pacientes, reduzindo-se os sintomas da beta-talasssemia: visto que os pacientes poderão produzir hemoglobina fetal (que não tem cadeias beta – sítio da mutação que assola os pacientes) para realizar o transporte de oxigênio em seus organismos.

Toda a comunidade científica aguarda ansiosa pelos resultados que poderão tornar a grande promessa de cura de doenças genética através da técnica CRISPR/Cas uma realidade, postergar um pouco mais esta almejada realidade para que ajustes na técnica sejam feitos, ou invalidar este sonho.

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A era da edição de genes humanos para curar doenças começou

Até a década de 1990, pessoas que sofriam de doenças genéticas não tinham expectativa real de cura. Nesta década, no entanto, cientistas começaram a desenvolver maneiras de se remover seletivamente genes de interesse do genoma de camundongos. A esperança de que no futuro a edição de genes fosse possível em seres humanos começou a ser alimentada. No século XXI, esta esperança se converteu em realidade e os responsáveis pelo desenvolvimento dos primórdios da edição de genes foram reconhecidos com o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina (https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2014/march/pros-and-cons-of-znfs-talens-and-crispr-cas). Em novembro do ano passado, vários sites noticiaram a pioneira e inovadora tentativa de edição de genes em seres humanos: Brian Madeux, de 44 anos, que sofre com a síndrome de Hunter, foi o primeiro ser humano a receber em seu organismo ferramentas de edição de genes visando sua cura (http://www.sciencemag.org/news/2017/11/human-has-been-injected-gene-editing-tools-cure-his-disabling-disease-here-s-what-you).

A síndrome de Hunter

A síndrome de Hunter é uma doença genética, o que significa que sua causa encontra-se em alterações no DNA dos pacientes. É também conhecida como mucopolissacaridose tipo II, pois a alteração no DNA prejudica a geração de proteína essencial (a iduronato-2-sulfatase) para o correto processamento de mucopolissacarídeos ou glicosaminoglicanos nas células. Estas substâncias então se acumulam nos lisossomos celulares causando comprometimentos graves ao paciente, como aumento do volume da cabeça e do abdômen, declínio de função cardíaca e atrasos no desenvolvimento. Quanto mais acúmulo de mucopolissacarídeos mal processados, mais evidentes e graves se tornam os sinais da síndrome (http://www.vidasraras.org.br/site/sindromes-raras/mucopolissacaridoses/mps-ii/367-mps-tipo-ii-o-que-e-a-sindrome-de-hunter).

No caso desta doença as alterações no DNA existem em diferentes versões e em diferentes regiões do gene da iduronato-2-sulfatase, localizado no cromossomo X (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1914889/). Alguns locais são mais comumente atingidos por estas alterações, sendo chamados de pontos quentes ou “hot spots” em inglês. O que estas alterações possuem em comum, no entanto, é impedirem a formação da versão correta desta proteína, essencial para o correto processamento dos mucopolissacarídeos e consequentemente o normal funcionamento celular.

As ferramentas mais comuns de edição de genes

As três mais famosas ferramentas que permitem a edição de genes são as nucleases dedos de zinco (ZFN), as nucleases TALE (TALEN) e o sistema CRISPR/Cas (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975017300617?via%3Dihub) (Figura 1). Estas possuem a capacidade de produzir quebra nas duas fitas do DNA no local para o qual foram destinadas pelo manipulador.

TALEN e ZFN trabalham em dímeros (duas unidades idênticas) e cada unidade contém uma região da proteína nuclease capaz de fazer o corte, derivado de uma outra proteína: a enzima de restrição FokI. Cada unidade possui ainda uma outra porção que faz o reconhecimento do local do DNA no qual o corte deve ser provocado.

Nas TALEN (Figura 1), esta porção de reconhecimento foi descoberta em patógenos de plantas e consiste em repetições (10 a 30 vezes) de aproximadamente 35 aminoácidos e 2 aminoácidos conferindo especificidade ao sistema (http://science.sciencemag.org/content/333/6051/1843.long). As versões comerciais mais comuns reconhecem e se ligam a um sítio de aproximadamente 18 pares de base no DNA alvo (https://www.jci.org/articles/view/72992).

Nas ZFN (Figura 1), o reconhecimento é de cerca de 3 ou 4 trincas de bases no DNA alvo para o corte no local desejado (https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0734-9750(14)00193-1). Das três ferramentas aqui abordadas foi a primeira a ser usada pelos cientistas para edição dirigida de genes .

No sistema CRISPR/Cas (Figura 1) (inspirado em mecanismo de defesa bacteriano), Cas é a nuclease responsável pela quebra de fita dupla no DNA (https://cientistasfeministas.wordpress.com/2017/05/11/entenda-a-nova-arma-da-engenharia-genetica-crisprcas9-e-a-polemica-envolvida/). No entanto, neste caso faz-se necessária a utilização de uma molécula de RNA, o RNA guia (gRNA), para o correto posicionamento da proteína. O reconhecimento do DNA alvo se dá por 18 a 20 nucleotídeos (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3712628/).

Para corrigir uma região de DNA responsável por causar doenças, é possível se utilizar estas ferramentas. Basta dirigir o corte para a região com erro e fornecer, juntamente do sistema de edição sítio-dirigida de genes, o trecho de DNA com sequência correta e braços de homologia nas duas extremidades. As sequências com homologia para a região de corte orientam a inserção do trecho de DNA com gene correto no local do corte. Assim, o DNA antes com o trecho incorreto ocasionando doença, contém agora a versão correta. No caso da doença de Hunter, seria a versão correta do gene da proteína iduronato-2-sulfatase, possibilitando às células depois da terapia, realizar o processamento correto dos mucopolissacarídeos.

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Figura 1: Ferramentas de edição sítio-dirigida de genes. (A) ZFN (domínio FokI em rosa e domínio endonuclease –de corte- em azul). B. TALEN (domínio FokI em rosa e domínio endonuclease –de corte- em verde). (C) CRISPR/Cas (gRNA em amarelo e nucleaseCas em vermelho); modificado de https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975017300617?via%3Dihub.

Primeira tentativa de edição genômica em seres humanos (in vivo) (https://apnews.com/4ae98919b52e43d8a8960e0e260feb0a/AP-Exclusive:-US-scientists-try-1st-gene-editing-in-the-body)

Em Novembro de 2017, na Califórnia-Estados Unidos, o paciente Brian Madeux recebeu por via intravenosa várias cópias da versão correta do gene da iduronato-2-sulfatase e de sequência codificadora de ZNFs visando eliminar de seu DNA o fator causador da Síndrome de Hunter.

O gene e duas versões de sequência codificadora de ZFN (visando garantir o corte o mais específico possível no DNA alvo) foram entregues em veia do paciente dentro de partículas virais (veículos para condução desta informação ao interior das células do paciente).

O órgão alvo foi o fígado e, segundo os especialistas envolvidos no experimento, apenas 1% das células sendo corrigidas em seu DNA já seria suficiente para o paciente apresentar melhora do quadro.

O protocolo foi aprovado nos Estados Unidos pelo NIH (National Institutes of Health) e realizado sob supervisão do médico responsável Paul Harmatz no hospital Oakland.

Na data de realização do procedimento a equipe médica divulgou que o paciente seria novamente avaliado em fevereiro de 2018, 3 meses após o procedimento, a fim de se verificar o resultado final de sucesso ou fracasso da estratégia.

O maior risco de fracasso para a empreitada seria a inserção do gene corrigido em local não desejado, prejudicando assim a função de outros genes e podendo ocasionar outras doenças como alguns tipos de câncer.

No entanto o procedimento foi bem sucedido em seu propósito (https://nypost.com/2018/02/06/scientists-see-positive-results-from-1st-ever-gene-editing-therapy/), proporcionando revolução no campo da terapia gênica visando cura de doenças genéticas em seres humanos.

Brian Madeux sentiu fraqueza e tontura quatro dias após a terapia, mas os sintomas só persistiram por 24 horas. Seu fígado não apresentou sinais de lesão, resultado almejado pelos médicos. Até o presente momento não há indícios de que a terapia apresente riscos no que tange segurança para uso em humanos.

Um novo paciente com a mesma síndrome já foi submetido ao tratamento e a equipe médica declarou em conferência que ambos passam bem. Novos protocolos serão desenvolvidos assim como novos mecanismos para garantir a segurança da técnica. Já existe projeto, por exemplo, de teste do protocolo para outras doenças, como a hemofilia.

Assim sendo, nos encontramos oficialmente na era da edição de genes humanos para curar de doenças.

 

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A terapia de estimulação cerebral profunda e a Doença de Parkinson

No dia 11 de abril se comemora o Dia Mundial de Combate ao Mal de Parkinson. A doença de Parkinson é degenerativa e afeta o sistema nervoso central (SNC). Dentre as doença degenerativa do SNC é a segunda mais comum (a doença de Alzheimer é a mais comum), acometendo 1 a cada 10 pessoas após os 80 anos de idade.

A doença de Parkinson acarreta morte celular progressiva no cérebro e na medula espinhal, ocasionando sintomas como tremor de repouso da musculatura e rigidez muscular, lentidão de movimentos, que se tornam descoordenados, perda de equilíbrio, dentre outros. Os sintomas podem evoluir para demência, se ocasionar comprometimento do pensamento nos pacientes.

As regiões mais afetadas são locais profundos no cérebro constituídos de substância negra: os gânglios basais (http://parkinsonhoje.blogspot.com.br/p/substancia-negra.html) (Figura 1). Estas regiões estão envolvidas em controle de postura e suavização/estabilização de movimentos musculares.

Figura 1

Figura 1: Gânglios da base (em azul) participantes no controle de posturas e movimentos musculares. Fonte: http://sistemanervosocentral304.blogspot.com.br/p/curiosidades.html

Para comunicar estímulos a neurônios vizinhos e alcançar as ações citadas acima, o principal neurotransmissor (mensageiro químico) utilizado pelos gânglios da base é a dopamina. Em pacientes com Parkinson, no entanto, este mensageiro encontra-se em teor reduzido, não podendo ser realizadas com eficiência as ações de coordenação de movimentos e postura (o que ocasiona os sintomas descritos). Os pacientes chegam a apresentar dificuldades para realizar tarefas simples do dia-a-dia, como beber água.

​Os indivíduos afetados podem ser tratados com fármacos como levodopa e/ou carbidopa (http://www.medicinanet.com.br/bula/1168/carbidopa_e_levodopa.htm) e requerem o atendimento mais multidisciplinar possível: envolvendo fisioterapia, fonoaudiologia, atendimento psicológico e avaliação nutricional. No entanto, existem outras estratégias de tratamento além da terapia com medicamentos (como uso de células tronco).

Até o momento não existe cura para a doença – apenas estratégias que visam melhora de qualidade de vida do paciente. Uma destas foi recentemente noticiada amplamente na mídia: a terapia de estimulação cerebral profunda, do inglês Deep Brain Stimulation (DBS).

A DBS (que pode ser realizada no Brasil em hospitais como Albert Einstein, HCor e Cassems – Campo Grande) é popularmente referida como marcapasso cerebral. Consiste em terapia invasiva reversível que implementa, via cirurgia, um eletrodo no cérebro. Por uma extensão sob a pele, que desce pelo pescoço até, geralmente, a parte superior do peito, este eletrodo se conecta ao neuroestimulador (semelhante ao marcapasso cardíaco) produtor de pulsos elétricos. Este neuroestimulador  é um dispositivo com bateria e componentes eletrônicos que tem como objetivo oferecer estimulação elétrica de alta frequência a regiões definidas dentro do cérebro, visando evitar sintomas motores incapacitantes da doença (Figura 2). A regulação do aparelho para cada paciente pode ser feita pelo médico de forma não invasiva para permitir maior controle imediato sobre os movimentos (no início é comum que a configuração dos padrões seja incômoda ao indivíduo).

Figura 2

Figura 2: Componentes da técnica de estimulação cerebral profunda. Fonte:  https://hospitaljoaoevangelista.wordpress.com/2012/05/08/tecnica-de-estimulacao-cerebral-profunda-pode-reverter-sintomas-da-doenca-de-alzheimer/

É um procedimento indicado a pacientes de 5 a 10 anos após o diagnóstico, nos quais os sintomas já se encontram em estágios moderadamente avançados; quanto mais precocemente se inicia o tratamento neste intervalo, maiores as chances de melhora potencializada na qualidade de vida do paciente. No geral, DBS permite a redução das medicações, favorecendo a redução dos efeitos colaterais que não costumam ser poucos. Apenas 8% das pessoas diagnosticadas, no entanto, se encontram no grupo daquelas para as quais o procedimento é recomendado, pois é procedimento invasivo, ou seja, envolve a realização de uma cirurgia.

O procedimento cirúrgico dura cerca de quatro horas e possui alto custo (aproximadamente R$ 150 mil que se somam a trocas de bateria de R$ 70 mil a cada 5 anos). O Sistema Único de Saúde (SUS), sob ordem judicial, já chegou a custeá-la para pacientes.

Grandes empresas do setor continuam a realizar pesquisas para ampliar o espectro de doenças para as quais a técnica pode ser utilizada para trazer benefícios, e para oferecer equipamentos mais precisos, de implementação mais simples e de materiais que causem menos interferências em metodologias de diagnóstico como ressonância magnética.

 

Principais referências utilizadas

HCor – Implante de marca-passo cerebral possibilita ao paciente com Mal de Parkinson retomar o controle de seus movimentos (2017) <http://www.hcor.com.br/imprensa/noticias/implante-de-marca-passo-cerebral-possibilita-ao-paciente-com-mal-de-parkinson-retomar-o-controle-de-seus-movimentos/ >.

dos Santos, A.; Mecchi, Y. (2017) De alto custo, marca-passo estimula cérebro e atenua Parkinson. <https://www.campograndenews.com.br/cidades/capital/de-alto-custo-marca-passo-estimula-cerebro-e-atenua-parkinson >.

Hospital Albert Einstein (2016) Centro de Estimulação Cerebral Profunda < https://www.einstein.br/especialidades/neurologia/estrutura/centro-estimulacao-cerebral-profunda&gt;.

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Animais transgênicos podem ser aliados da saúde humana

Ao final do ano de 2015, uma notícia sobre transgênicos causou rebuliço na internet. A FDA, agência que regulamenta e fiscaliza assuntos relacionados a fármacos e alimentos nos Estados Unidos, considerou pela primeira vez um animal transgênico como seguro para integrar a alimentação humana (https://super.abril.com.br/ciencia/eua-liberam-venda-de-salmao-transgenico-entenda/). Tratava-se do salmão do atlântico transgênico AquAdvantageSalmon® que cresce muito mais rápido que um salmão não transgênico. Esse peixe foi gerado em laboratório para produzir hormônio de crescimento mesmo em temperaturas muito baixas, nas quais salmões não transgênicos param de crescer (http://www.nature.com/nbt/journal/v10/n2/full/nbt0292-176.html).

Muitas pessoas associam transgênico apenas à melhora de características intrínsecas do organismo, como o caso do salmão ou à aquisição de característica de resistência como a de algumas sementes atualmente comercializadas como as de milho resistentes a insetos. O posicionamento de entidades contra os transgênicos e a escassa informação sobre estudos de longa duração em linguagem acessível à população fazem com que o termo “transgênico” pareça assustador para muitas pessoas. O objetivo deste texto é desmistificar o papel de vilão dos transgênicos, mostrando as funções benéficas aos seres humanos, em especial o de produção de moléculas de interesse, principalmente para fins de terapia.

Primeiramente, é importante mencionar o que significa transgenia. Transgenia é um dos tipos de modificação genética que se pode realizar em um organismo. Ela consiste em se inserir no DNA de um organismo, um trecho de DNA oriundo de outro organismo e capaz de levar à produção de uma proteína que seja de interesse do manipulador  (http://books.scielo.org/id/sfwtj/pdf/andrade-9788575413869-42.pdf). A sequência que se transfere ao organismo alvo é camada de transgene; se ela for oriunda de um organismo de mesma espécie chama-se o animal gerado de autotransgênico, e se for de espécie diferente, alotransgênico – este último também comumente referido como transgênico, apenas (http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1095-8649.2007.01738.x/abstract) (Figura 1).

Figura 1 blog

Figura 1: Geração de auto ou alotransgênicos (exemplificado para peixes) – nos autotransgênicos a sequência de DNA de interesse é oriunda de organismo de mesma espécie; no alotransgênico (popularmente conhecido como transgênico) a sequência de DNA é oriunda de espécie diferente.

Assim sendo, todo animal transgênico é geneticamente modificado, mas nem todo geneticamente modificado é um transgênico. Modificações genéticas também podem incluir remoção de sequências do DNA alvo e alteração de sequências com propósitos definidos (http://www.unifesp.br/campus/sao/cedeme/modelos-animais/camundongos/animais-geneticamente-modificados), e por esta razão estes dois termos não são sinônimos.

Como os animais transgênicos são produzidos?

Animais transgênicos são gerados em sua maioria por uma técnica clássica proposta na década de 1970,chamada microinjeção de ovos recém-fertilizados. Esta técnica consiste em injetar, com ajuda de uma microagulha de vidro, o transgene no ovo recém-fertilizado (logo após a fertilização in vitro por junção dos gametas (http://www.biotecnologiaanimal.com.br/fecundacao-in-vitro-fiv/tecnicas-e-procedimentos)). A integração no genoma alvo geralmente ocorre após as primeiras divisões celulares terem acontecido, produzindo um transgênico mosaico – contendo a modificação genética em algumas de suas células e em outras não. Após o cruzamento destes animais com animais não modificados, os transgênicos totais poderão ser encontrados na prole (Figura 2).

Figura 2 blog

Figura 2: Microinjeção de ovos recém-fertilizados para geração de animal transgênico (exemplificado para peixes) – os gametas são utilizados para fertilização in vitro e em seguida injeta-se a sequência de interesse. É comum que a integração no genoma alvo, quando ocorre, aconteça após algumas divisões celulares, produzindo-se assim um transgênico mosaico. Este pode ser cruzado com animais não modificados para obtenção do transgênico total.

O primeiro organismo transgênico a ser gerado intencionalmente por pesquisadores foi uma bactéria, produzida em 1973 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC427208/), e o primeiro animal transgênico produzido em laboratório foi um camundongo (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC388203/), gerado por microinjeção em 1974.

A produção de animais transgênicos visa, em sua maioria, conferir a estes, características que tornem mais lucrativo sua criação e mais rápida sua comercialização por exemplo, tolerância maior ao frio, resistência a doenças, crescimento mais rápido que o normal da espécie ou utilizar os animais como fábricas para a produção de moléculas de interesse humano (hormônios, enzimas, anticorpos etc.) (https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/animais-transgenicos/16643).

Já foram gerados, por exemplo, versões de leites enriquecidos em proteínas importantes como ativador de plasminogênio tecidual (https://www.nature.com/nbt/journal/v5/n11/full/nbt1187-1183.html) e antitrombina humanos (http://www.biopharminternational.com/production-recombinant-therapeutic-proteins-milk-transgenic-animals). Ambos encontram-se envolvidos com o processo de manutenção da fluidez sanguínea, se opondo ao processo de coagulação. O primeiro pode ser utilizado em tratamento médico visando destruição de trombos como no caso de embolia pulmonar; e o segundo, principalmente para prevenir a formação de trombos, principalmente em pacientes deficientes hereditários de antitrombina que vão se submeter a parto ou cirurgias.

A antitrombina produzida em cabras transgênicas e liberada no leite culminou no medicamento ATryn®, primeiro produto recombinante produzido em animais aprovado para uso humano na Europa e nos Estados Unidos (http://www.atryn.com).

Já é também realidade a produção de proteína básica de mielina no leite de vaca (https://www.sciencelearn.org.nz/resources/856-transgenic-cows-making-therapeutic-proteins). Esta proteína é parte da camada isolante necessária para a rápida condução de impulsos nervosos em nossos neurônios, sendo alvo de estudos que buscam seu possível potencial terapêutico no tratamento de esclerose múltipla (doença autoimune na qual o paciente sofre com perda desta camada isolante e consequentemente tem comprometimento de condução de impulsos nervosos pelo seu organismo).

Assim sendo, os transgênicos podem ser aliados da saúde humana, sendo fábricas eficientes de proteínas que possam ser utilizadas para fins terapêuticos (http://www.nanocell.org.br/biotecnologia-transformadora-totalmente-brasileira/). A oportunidade de manipulação genética ainda oferece a possibilidade de redução de custos na obtenção das proteínas de interesse, podendo refletir em redução de preço final dos medicamentos para o consumidor final.