Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico da COVID-19

Vamos continuar falando sobre o novo coronavírus responsável pela pandemia que estamos vivendo agora? E se ao invés de falarmos de medidas sociais e políticas de contenção da propagação do vírus, e manifestações clínicas da doença, aprendermos um pouco sobre como funciona uma técnica molecular conhecida por RT-qPCR utilizada para o diagnóstico da doença COVID-19?

Essa técnica é capaz de identificar o material genético do vírus SARS-CoV-2 em amostras coletadas da nasofaringe e orofaringe de pacientes com suspeita de infecção pelo vírus. Ela baseia-se na detecção de regiões presentes em alguns genes que são conservadas no vírus, ou seja, regiões que praticamente não tem mudanças na sua constituição. Essas regiões devem ainda ser diferentes de sequências encontradas em outros organismos para que ao serem detectadas tenhamos garantia que estamos detectando especificamente o vírus SARS-CoV-2 e não outro vírus, como o H1N1, por exemplo.

A técnica utilizada para a detecção dessas regiões gênicas conservadas é conhecida como PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e baseia-se na reprodução em laboratório de uma reação que ocorre normalmente em nossas células antes delas se dividirem para renovação de tecidos, crescimento, cicatrização ou formação dos gametas sexuais. Sempre antes de uma célula se dividir, seja por mitose ou meiose, ela precisa duplicar o seu material genético, processo conhecido como replicação.

Para entender o processo precisamos lembrar que no núcleo das nossas células encontra-se o DNA que é composto por duas fitas constituídas cada uma por uma sequência de nucleotídeos, as unidades básicas do DNA e RNA. No DNA, os nucleotídeos são formados por 3 moléculas: uma base nitrogenada (guanina, citosina, timina ou adenina), um açúcar desoxirribose e um grupo fosfato (Figura 1). Para que o DNA seja duplicado, é preciso que as suas duas fitas separem-se, função realizada no nosso organismo pela enzima helicase que atua junto a uma outra enzima denominada topoisomerase. Após a separação das fitas, pequenas sequências de nucleotídeos, os primers, irão se ligar nas duas fitas determinando onde uma outra enzima, a DNA polimerase, irá começar a gerar uma nova fita de DNA (Figura 2). Os primers são responsáveis por orientar o local no DNA em que a enzima DNA polimerase deve se ligar e começar a adicionar novos nucleotídeos para dar origem a nova fita em formação. 

Figura 1 – O DNA e suas unidades fundamentais – A. E. B. Andrade et al.

Para realizar a PCR (Figura 3) no laboratório fazemos com que essa reação que ocorre no interior das células ocorra dentro de um tubo onde são adicionados os reagentes necessários: uma enzima DNA polimerase adaptada para resistir a altas temperaturas, os nucleotídeos que irão constituir a nova fita de DNA, os primers que irão determinar o local do gene onde a duplicação deve ser iniciada e um DNA molde que no caso de SARS-CoV-2 é obtido através da coleta de material presente nas vias respiratórias do paciente. A enzima polimerase utilizada na PCR só é capaz de duplicar DNA e já vimos que o vírus SARS-CoV-2 apresenta RNA como material genético. Portanto, precisamos extrair o RNA do vírus e realizar inicialmente uma etapa denominada transcrição reversa que irá produzir um DNA a partir do RNA. Devido a essa etapa a PCR passa a ser então chamada de RT-PCR (Transcrição Reversa seguida de PCR). Uma vez obtido esse DNA pode-se então iniciar a PCR propriamente dita. Após acrescentar todos os reagentes, o tubo é inserido em um equipamento chamado termociclador que é capaz de promover aumentos e reduções de temperatura. Se você prestou bastante atenção reparou que não acrescentamos as enzimas helicase e topoisomerase responsáveis pela separação das duas fitas de DNA. Essa separação é realizada graças ao aumento de temperatura: quando o termociclador atinge uma faixa de temperatura entre 94°C e 96°C, a fitas de DNA se desnaturam e separam-se. Essa etapa é conhecida como etapa de desnaturação. As fitas precisam ser separadas para que os primers se liguem e as novas fitas sejam formadas pela ação da DNA polimerase. Na etapa de anelamento, os primers irão se ligar a suas regiões alvo em temperaturas próximas a 60°C, a depender do seu tamanho e constituição. Na etapa final, conhecida por etapa de extensão, irá ocorrer a formação da nova cadeia de DNA a partir da adição de nucleotídeos pela enzima DNA polimerase que apresenta temperatura ótima de 72°C. Após a adição dos nucleotídeos a nova cadeia é formada e o ciclo se reinicia na etapa de desnaturação, seguida pela de anelamento e por último pela de extensão. Essas etapas irão se repetir por várias vezes até que no final de vários ciclos tenhamos bilhares de novas moléculas que serão então capazes de ser detectadas. Essa é a principal função da PCR, fazer com que uma pequena quantidade de moléculas de DNA incapazes de serem detectadas inicialmente origine bilhões de moléculas ao final do processo que serão capazes de serem detectadas. Dizemos, portanto, que a PCR é uma reação de amplificação pois há um aumento na quantidade de DNA ao final do processo.

Figura 3 – Reagentes e Etapas da PCR convencional. Disponível em: https://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/molecular-biology-principle-pcr

Até aqui descrevemos como funciona a PCR convencional e a RT-PCR, mas se você é um ótimo observador reparou que logo no início do texto citei que a técnica molecular utilizada para diagnóstico da doença se chama RT-qPCR. Esse “q” refere-se a “quantitativo”, uma vez que nessa reação o produto da PCR é medido (quantificado)/analisado em tempo real, diferente da reação de PCR convencional em que só ao final da reação podemos visualizar se houve ou não amplificação da sequência de interesse. Para que possamos observar em tempo real essa amplificação precisamos então adicionar no tubo de reação, além de todos os reagentes já citados, um reagente de extrema importância: a sonda. Assim como os primers, as sondas são oligonucleotídeos, ou seja, também são formadas por uma sequência pequena de nucleotídeos que irá se ligar à sequência alvo de interesse na fita de DNA. Mas as sondas possuem uma característica especial, apresentam em sua estrutura um agente fluorescente capaz de emitir cor que é detectada por um sistema acoplado ao termociclador toda vez que ocorre amplificação da região de interesse (Figura 4). Quanto mais DNA amplificado maior será o sinal de fluorescência detectado. Podemos utilizar várias sondas em uma mesma reação de PCR com capacidades de emitir fluorescência em diferentes cores podendo assim detectar várias regiões do DNA diferentes ao mesmo tempo.

Figura 4 – Emissão de fluorescência por uma sonda na PCR em tempo real. Disponível em: https://kasvi.com.br/pcr-em-tempo-real-qpcr-diagnostico-doencas/

Em relação ao SARS-CoV-2, existe atualmente uma série de protocolos disponíveis para sua detecção validados pela Organização Mundial da Saúde e que utilizam como alvos diferentes genes. Os genes virais escolhidos durante o desenvolvimento desses testes foram o N (codifica a proteína do nucleocapsídeo), E (codifica a proteína do envelope), S (codifica a proteína espícula) e RdRp (codifica a enzima RNA polimerase dependente de RNA) (Figura 5). O protocolo inicialmente sugerido pelo Ministério da Saúde foi o Charité que detectava a presença de regiões dos genes “N”, “E” e “RdRp” (Figura 6). Observe que eu escrevi “regiões dos genes”, isso porque são detectadas regiões mais conservadas dentro de cada um desses genes, os genes completos possuem um tamanho muito grande sendo a detecção de apenas parte deles já suficiente para o diagnóstico. Posteriormente, a detecção da região do gene “N” que era utilizada apenas como teste de triagem foi removida do protocolo, mantendo-se a detecção apenas de regiões do gene “E” e “RdRp” utilizadas como teste confirmatório (Figura 7). Os primeiros testes começaram a ser desenvolvidos antes de se ter disponível o sequenciamento do genoma de SARS-CoV-2 baseando-se apenas nos dados que existiam do sequenciamento de SARS-CoV humano e SARS-CoV isolado de morcegos. Portanto, ao detectar a presença do material genético poderia ser tanto devido a infecção por SARS-CoV-2 quanto também poderia ser por SARS-CoV. Como a SARS, Síndrome Respiratória Aguda Grave causada por SARS-CoV, já foi eliminada em humanos, os casos suspeitos que apresentassem resultado positivo no teste de RT-qPCR deveriam ser considerados infectados por SARS-CoV-2. Atualmente acrescentou-se a detecção de uma região específica de SARS-CoV-2 localizada dentro do gene RdRp tornando, portanto, o teste diagnóstico discriminatório, ou seja, capaz de afirmar que a detecção daquela região é devido a contaminação especificamente pelo vírus SARS-CoV-2 e não outro coronavírus relacionado a SARS. Podemos observar na figura 8 que a sonda RdRp_SARSr-P2, representada por pontinhos marcados em verde, é capaz de ligar apenas em SARS-CoV-2 uma vez que a sua sequência é a mesma encontrada nas 6 sequências disponíveis de SARS-CoV-2 (as 6 primeiras sequências) e não é a mesma das sequências de SARS-CoV isolado de humanos ou morcegos (as 3 últimas sequências).  Os pontinhos representam nucleotídeos idênticos comparados a sequência de SARS-CoV-2 “WH_Human_1” enquanto as letras representam os nucleotídeos diferentes encontrados. E aí, gostou de aprender um pouquinho mais de biologia molecular aplicada à detecção do vírus SARS-CoV-2?

Figura 5 – Estrutura do coronavírus responsável pela síndrome respiratória. Adaptado de Shereen et al.
Figura 6 – Posições relativas das regiões detectadas inicialmente pela reação de RT-qPCR no genoma de SARS-CoV e SARS-CoV-2. V. M. Corman et al.
Figura 7 – Posições relativas das regiões detectadas pela reação de RT-qPCR no genoma de SARS-CoV e SARS-CoV-2. V. M. Corman et al.
Figura 8 – Alinhamento parcial das regiões em que os nucleotídeos se ligam em coronavírus relacionados a SARS (n=9). Adaptado de V. M. Corman et al.

Referências:

Biologia Molecular Básica, A. Zaha, H. B. Ferreira, L. M. P Passaglia, Artmed, 5ª edição.

Biologia Molecular da Célula, A. E. B. Andrade, C. V. Bizarro, G. Renard, Artmed, 6ª edição.

Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases by RT-PCR. Disponível em: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4.

Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR using Charité, Berlin Germany protocol. Disponível em: https://www.solisbiodyne.com/images/2020%2003%2025_Charite%20protocol_Solis%20BioDyne.pdf.

M. A. Shereen et al., COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses, Journal of Advanced Research, , https://doi.org/10.1016/j.jare.2020.03.005.

Técnicas Básicas em Biologia Molecular, M. T. De-Souza, M. M. Brigido, A. Q. Maranhão, Editora UnB, 2ª edição.

V. M. Corman et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR, Euro Surveill, https://doi.org/10.2807/1560-7917.

https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr.

https://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/molecular-biology-principle-pcr.

2 comentários sobre “Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico da COVID-19

  1. Pingback: Origem e transmissão: uma visão geral sobre a pandemia do COVID-19 | cientistasfeministas

  2. Pingback: Marcha pela Ciência: por que ainda estamos marchando por fatos? | cientistasfeministas

Deixe um comentário

Preencha os seus dados abaixo ou clique em um ícone para log in:

Logotipo do WordPress.com

Você está comentando utilizando sua conta WordPress.com. Sair /  Alterar )

Foto do Google

Você está comentando utilizando sua conta Google. Sair /  Alterar )

Imagem do Twitter

Você está comentando utilizando sua conta Twitter. Sair /  Alterar )

Foto do Facebook

Você está comentando utilizando sua conta Facebook. Sair /  Alterar )

Conectando a %s